1 CRISPR/Cas9系统及其发展历程

1987年, Ishino等在大肠杆菌基因组中发现间隔重复序列。直到2002年Jansen等才将其命名为“成簇的规律间隔短回文重复序列,简称CRISPR”。CRISPR广泛存在于细菌和古菌中,具有抗病毒感染、DNA修复和修饰等重要作用。直到2012年Doudna和Charpentier才证实CRISPR具有基因编辑能力。同年,Sternberg等发现Cas9蛋白可以完成靶序列编辑。一年后,Cong等首次将CRISPR/Cas9系统运用于哺乳动物基因组编辑中。

CRISPR/Cas9系统主要由三部分组成:crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。借助碱基互补配对原则,crRNA与tracrRNA可以形成crRNA-tracrRNA结构,嵌合成1条小向导RNA (small guide RNA, sgRNA),引导Cas9蛋白在目标DNA序列上进行双链切割。在靶DNA切割前,Cas9蛋白在sgRNA引导下,识别原间隔序列邻近基序,并对其上游的目标DNA序列进行切割。DNA双链断开后,其修复机制主要依赖于非同源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ) 和同源介导修复 (homology-directed repair, HDR)。NHEJ是一种随机修复机制,通过插入或缺失引起DNA序列移码突变,从而实现基因敲除或基因组元件失效。HDR则是一种精确修复机制,依赖导入外源DNA模板,在断裂处进行同源重组,实现定点插入、删除、突变等操作。CRISPR/Cas9系统在基因编辑历程中具有里程碑意义,已被广泛应用于医学、农学、生命科学等学科。研究者利用CRISPR/Cas9系统,可以研究疾病模型、开发治疗药物、制备转基因动物、研究基因功能等,因而具有重要意义。

2 EVs概述

CRISPR/Cas9系统能快速、高效进行基因编辑,在疾病模型和疾病治疗等方面具有重要作用,但仍然缺乏安全有效的传递载体,这限制了CRISPR/Cas9系统的临床应用。目前,EVs是最具潜力的传递载体之一。EVs根据其大小和来源主要分为外泌体、微泡和凋亡小体,其中凋亡小体和微泡可通过细胞膜直接出芽产生,而外泌体是多泡体和溶酶体融合后释放出的腔内囊泡或与细胞膜融合后被释放出的囊泡。EVs作为一种天然纳米级载体,相较于传统病毒载体和非病毒载体具有显著优势,如优良的生物相容性和低免疫原性等。此外,EVs可携带生物大分子在细胞间穿梭,穿过血脑屏障、胎盘屏障、肠道屏障等生物屏障。因此,EVs有望成为最有前景的递送载体。特别是EVs可以传递核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP) 复合物,RNP复合物是一种非常理想的递送物质,是由特定蛋白质与特定RNA形成的复合体,包括在体外与Cas9蛋白复合的sgRNA。通过降低DNA序列被整合时存在的潜在风险和RNA易降解的缺点,RNP可以提高基因编辑效率,对治疗遗传性疾病或感染性疾病具有重要作用。因此,可以预见EVs在未来成为传递CRISPR/Cas9系统优势载体的潜在价值。

参考文献